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恐懼和焦慮是不同的適應(yīng)性反應(yīng)，對生存至關(guān)重要。恐懼是由離散且確定的威脅刺激引發(fā)的，而焦慮則源于對潛在威脅的預(yù)期。杏仁核中央核（CeA）對于離散條件化恐懼反應(yīng)的獲得和表達至關(guān)重要，其在僵硬行為中的特定神經(jīng)元亞群的作用也已得到充分證實。以往的研究強調(diào)了終紋床核（BNST）在應(yīng)對不可預(yù)測或持續(xù)時間較長的威脅時的防御反應(yīng)中的作用。然而，與不可預(yù)測威脅處理和病理性焦慮相關(guān)的神經(jīng)環(huán)路仍然知之甚少。

在此，作者通過使用改良的可預(yù)測CS（CS?）或不可預(yù)測CS（CS?）動物模型，發(fā)現(xiàn)島葉皮層對vBNST的興奮性輸入和杏仁核側(cè)核（CeL）對vBNST的抑制性輸入?yún)f(xié)同作用，觸發(fā)vBNST中GABA能神經(jīng)元對不可預(yù)測而非可預(yù)測威脅信號的選擇性激活。作者進一步發(fā)現(xiàn)，vBNST中的GABA能神經(jīng)元通過投射到杏仁核中央核（CeM）和腹側(cè)導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（vlPAG）分別調(diào)節(jié)焦慮樣行為和僵硬行為。

1.vBNST中特定的GABA能神經(jīng)元群體調(diào)節(jié)對不可預(yù)測威脅的反應(yīng)

為了確定vBNST在應(yīng)對不可預(yù)測威脅時的神經(jīng)元動態(tài)，小鼠接受了改良的恐懼條件反射（FC）任務(wù)訓(xùn)練。CS+和CS-信號均能引發(fā)小鼠的凍結(jié)行為（圖1A和1B）。晚期FC試驗中對CS-的神經(jīng)反應(yīng)顯著強于適應(yīng)期和早期FC試驗（圖1B-1E）。在CS測試實驗中，vBNST神經(jīng)元的Ca2+信號在CS-測試期間選擇性增加，而在CS+測試期間沒有變化（圖1F和1G）。vBNST中Vgat神經(jīng)元的Ca2+信號在CS-測試期間顯著升高（圖1H-1L）。作者的結(jié)果表明vBNST中的GABA能神經(jīng)元在應(yīng)對不可預(yù)測威脅信號時被選擇性激活。并且研究了vBNST GABA能神經(jīng)元在應(yīng)對不可預(yù)測威脅時的防御行為中的作用。在CS測試期間人工抑制vBNST中的GABA能神經(jīng)元，對CS-的凍結(jié)行為減少，而對CS+的凍結(jié)行為正常（圖2D和2E）。在沒有CS回憶的新環(huán)境中人工激活了vBNST中的CS-反應(yīng)性神經(jīng)元群體，發(fā)現(xiàn)ChR2-mCherry組的凍結(jié)行為增加（圖2M）。這些發(fā)現(xiàn)表明vBNST中不同的GABA能神經(jīng)元分別調(diào)控凍結(jié)和攝食行為。

圖1. 皮層-腦干緩慢呼吸環(huán)路的鑒別

圖2. vBNST中的GABA能神經(jīng)元調(diào)節(jié)對不可預(yù)測威脅的反應(yīng)

2. 激活I(lǐng)C-vBNST回路對應(yīng)對不可預(yù)測威脅至關(guān)重要

IC（島葉皮層）、CeL（中央杏仁核外側(cè)部）和CeM（中央杏仁核內(nèi)側(cè)部）顯示出更多向vBNST CS-反應(yīng)性細胞的投射，而vBNST攝食反應(yīng)性細胞則接收更多來自vCA1（腹側(cè)海馬CA1區(qū)）、ZI（未定帶）、PAG（導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)）和NTS（孤束核）的投射。IC引起了作者的興趣，因為它在恐懼記憶回憶期間被激活，并且在焦慮障礙中報告了功能改變。作者發(fā)現(xiàn)，投射到vBNST的IC神經(jīng)元在CS+和CS-測試期間均表現(xiàn)出激活增加（圖3C和3D）。通過全細胞記錄驗證了從IC到vBNST的單突觸興奮性連接的存在。電流鉗記錄顯示，藍光脈沖在感染AAV-ChR2(H134R)-EYFP的IC神經(jīng)元中誘導(dǎo)了時間鎖定的動作電位發(fā)放（圖3E和3F）。短暫的光刺激vBNST中含有ChR2的IC末端，當(dāng)膜電壓保持在-70 mV時，在GABA能神經(jīng)元中誘發(fā)了興奮性突觸后電流（eEPSCs）。這些eEPSCs被浴液中的河豚毒素（TTX）消除，并可以通過應(yīng)用鉀通道阻滯劑4-氨基吡啶（4-AP）恢復(fù)。此外，eEPSCs可以被AMPAR拮抗劑NBQX消除（圖3G和3H）。

光遺傳學(xué)抑制IC-vBNST回路可以減少對CS-測試的凍結(jié)水平，但對CS+測試沒有影響（圖3I-3K）。因此，作者的結(jié)果證實，IC中的谷氨酸能神經(jīng)元與vBNST中的GABA能神經(jīng)元建立了單突觸連接，并且這些投射到vBNST的IC神經(jīng)元在應(yīng)對可預(yù)測或不可預(yù)測威脅信號時表現(xiàn)出高活性。

圖3. IC的興奮性投射到vBNST調(diào)節(jié)對不可預(yù)測威脅信號的反應(yīng)

3. CeL SOM?神經(jīng)元的前饋抑制控制vBNST對不可預(yù)測威脅的反應(yīng)

在CS?測試期間，vBNST可能通過其他傳入神經(jīng)元的前饋抑制進行調(diào)控。逆行示蹤結(jié)果顯示，CeL向vBNST中對CS?反應(yīng)的細胞群發(fā)送投射。因此，作者推測在CS?測試期間，CeL可能對vBNST施加前饋抑制。作者針對投射到vBNST的CeL神經(jīng)元，通過體內(nèi)纖維光度法記錄其Ca²?信號（圖4A和4B）。投射到vBNST的CeL神經(jīng)元的Ca²?信號僅在CS?測試中升高（圖4C和4D）。

生長抑素（SOM）和蛋白激酶Cδ（PKCd）神經(jīng)元是CeL中兩種重要的GABA能抑制性神經(jīng)元，它們大部分不重疊，代表功能不同的神經(jīng)元。接下來，作者發(fā)現(xiàn)抑制CeLSOM-vBNST投射對CS?或CS?測試均無影響（圖4G-4I）。人工激活CeLSOM-vBNST投射在未經(jīng)過訓(xùn)練的小鼠中無法誘發(fā)僵硬行為，并且降低了對CS?的僵硬水平，但對CS?測試沒有影響（圖4J-4M）。激活CeLSOM-vlPAG投射可以在未經(jīng)過訓(xùn)練的小鼠中誘發(fā)僵硬行為。抑制CeLSOM-vlPAG投射會損害CS?測試中的僵硬行為（圖S5）。因此，CeL中特定的SOM?神經(jīng)元亞群在CS?測試期間對vBNST施加前饋抑制。

圖4. BNST投射的細胞神經(jīng)元通過抑制性突觸傳遞控制vBNST對不可預(yù)測威脅的反應(yīng)

4. vBNST-vlPAG和vBNST-CeM環(huán)路分別調(diào)控僵硬行為和焦慮樣行為

vBNST中對不可預(yù)測威脅反應(yīng)的神經(jīng)元群激活會導(dǎo)致焦慮樣行為，然而這些神經(jīng)元群的下游效應(yīng)尚不清楚。為了探究這一問題，作者進行了活動依賴性神經(jīng)元順行示蹤實驗，追蹤vBNST中對條件刺激（CS?）反應(yīng)的細胞和進食反應(yīng)的細胞的輸出。發(fā)現(xiàn)vBNST中CS?反應(yīng)性細胞更傾向于向CeM、vlPAG和VTA發(fā)送投射，而vBNST中進食反應(yīng)性細胞更傾向于向PVN、LH和NTS發(fā)送投射。作者通過光遺傳學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，人工激活vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群的下游靶點（vlPAG）可以誘導(dǎo)小鼠在新環(huán)境中或在曠場實驗（OFT）中增加僵硬行為，而激活CeM則沒有這種效果。相反，激活從vBNST中CS?反應(yīng)性細胞到CeM的投射可以誘導(dǎo)焦慮樣行為。激活vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群到CeM的信號通路對OFT中的總行進距離沒有影響，這表明從vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群到CeM的環(huán)路可能有助于焦慮樣行為，但與運動無關(guān)。因此，vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群通過不同的輸出在應(yīng)對不可預(yù)測威脅信號時發(fā)揮不同行為的作用。具體來說，vBNST-vlPAG環(huán)路有助于僵硬行為，而vBNST-CeM環(huán)路有助于焦慮樣行為。

圖5. vBNST中對CS?反應(yīng)的神經(jīng)元分別投射到腹側(cè)導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)和中央杏仁核，分別調(diào)節(jié)僵硬行為和焦慮樣行為

5. 針對vBNST環(huán)路的調(diào)控為焦慮癥治療提供了潛在方向

vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群在不可預(yù)測威脅誘導(dǎo)的焦慮中的生理作用尚不清楚。為了研究這一問題，作者在慢性不可預(yù)測應(yīng)激（CUS）處理后記錄了CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群的活動。CUS組小鼠在曠場實驗（OFT）和高架十字迷宮（EPM）測試中表現(xiàn)出更高的焦慮樣行為（圖S7E和S7F）。為了進一步研究vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群在焦慮樣行為中的作用，作者進行了光遺傳學(xué)實驗。研究結(jié)果表明，抑制vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群可以緩解CUS處理小鼠的焦慮樣行為（圖S7G-S7I）。

此外，作者發(fā)現(xiàn)抑制vBNST-CeM環(huán)路可以改善在OFT和EPM測試中觀察到的高焦慮樣行為（圖S7J-S7L）。因此，vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群的過度激活通過投射到CeM促進了CUS誘導(dǎo)的焦慮，而靶向vBNST中CS?誘導(dǎo)的神經(jīng)元群可能是緩解焦慮行為的潛在策略。

6. KCNQ3是通過穩(wěn)定vBNST活動來治療不可預(yù)測應(yīng)激誘導(dǎo)焦慮的潛在靶點

vBNST對不可預(yù)測威脅反應(yīng)的神經(jīng)元群活動發(fā)生改變的分子機制尚不清楚。因此，作者采用磷酸化翻譯核糖體親和純化（pTRAP）技術(shù)結(jié)合RNA測序，以鑒定vBNST對不可預(yù)測威脅反應(yīng)的關(guān)鍵分子。作者通過qPCR驗證了vBNST神經(jīng)元中鉀通道表達的下調(diào)，其中KCNQ3 mRNA的表達下調(diào)最為顯著（圖6D）。免疫熒光染色證實，與CS?測試相比，vBNST中GABA能神經(jīng)元的KCNQ3表達在CS?測試中更低（圖6E和6F）。

隨后，通過Western blot實驗研究了慢性不可預(yù)測應(yīng)激（CUS）處理與KCNQ3表達之間的關(guān)系。CUS處理后KCNQ3蛋白和mRNA水平的下降（圖6G-6I）。vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元的內(nèi)在興奮性增加，且在腦片膜片鉗記錄中M型電流降低（圖7A-7E）。在CUS處理后，小鼠在家庭籠中vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元的活動增加被抑制，導(dǎo)致在vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元中過表達KCNQ3后焦慮樣行為的相應(yīng)減少（圖7F-7K）。將KCNQ家族通道的激動劑瑞替加濱注入vBNST可以減輕CUS處理后觀察到的電生理和行為改變，以及不可預(yù)測應(yīng)激后vBNST中CS?反應(yīng)性神經(jīng)元群的過度活躍和焦慮行為（圖S12）。

圖6. 在CS?測試和CUS處理后，KCNQ3水平的降低被識別出來

結(jié)論

作者的研究闡明了調(diào)控不可預(yù)測威脅誘導(dǎo)焦慮的協(xié)同興奮性和抑制性神經(jīng)環(huán)路。vBNST中特定的GABA能神經(jīng)元作為不可預(yù)測威脅信息匯聚和焦慮誘導(dǎo)的中心，而KCNQ通道在神經(jīng)元興奮性中發(fā)揮重要作用。本研究對于理解不可預(yù)測威脅誘導(dǎo)焦慮的神經(jīng)環(huán)路以及識別不可預(yù)測應(yīng)激后焦慮癥治療的潛在分子靶點具有重要意義。

SA218型場景恐懼實驗系統(tǒng)（FCS）用于小型嚙齒類動物（大、小鼠）環(huán)境相關(guān)條件性恐懼實驗研究。嚙齒類動物在恐懼時會表現(xiàn)出特有的不動狀態(tài)（immobility），動物在這種情況下傾向于保持靜止不動的防御姿勢。抗抑郁藥和抗中樞興奮藥可以明顯縮短不動狀態(tài)持續(xù)的時間。實驗過程中，實驗對象被給與一個聲音信號（條件刺激），隨后給予電擊（非條件）刺激。該訓(xùn)練稱為條件性訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后實驗動物進行聲音信號或環(huán)境聯(lián)系性實驗。一般情況下嚙齒類動物對相應(yīng)的環(huán)境和不同環(huán)境下同樣的聲音信號都會做出明顯的條件性恐懼反應(yīng)，如靜止不動。這種測試可以在訓(xùn)練結(jié)束后立刻或幾天后進行可以提供在條件信號影響下短期和長期記憶的信息。

曠場實驗箱

SA215型曠場實驗視頻分析系統(tǒng)（open field test）是觀察研究實驗動物神經(jīng)精神變化、進入開闊環(huán)境后的各種行為，例如動物對新開闊環(huán)境的恐懼而主要在周邊區(qū)域活動，在中央?yún)^(qū)域活動較少，但動物的探究特性又促使其產(chǎn)生在中央?yún)^(qū)域活動的動機，也可觀察由此而產(chǎn)生的焦慮心理。

高架十字迷宮

SA211型高架十字迷宮是利用動物對新異環(huán)境的探究特性和對高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動物的焦慮狀態(tài)。目前被廣泛應(yīng)用于新藥開發(fā)、藥理學(xué)、毒理學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、動物心理學(xué)等多個學(xué)科的科學(xué)-研究和計算機輔助教學(xué)等領(lǐng)域。